H-Brücken | DNA-Isolation | Denaturierung | Renaturierung | Hybridisierung
Das Zentrum der DNA wird von den Basen gebildet und ist
demzufolge hydrophob. Die basischen Ringe, die nach innen ragen, sind
den Stufen einer Wendeltreppe vergleichbar und liegen senkrecht zur
Helixachse. Es liegen sich immer zwei Basen gegenüber, welche
durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden sind. Ein
Purin-Ring bildet immer mit einem Pyrimidin-Ring ein Basenpaar und
umgekehrt (d.h. sie sind komplementär), da zwei sich
gegenüberliegende Purin-Ringe in einer Doppelhelix zuviel Platz
beanspruchen würden, während zwei Pyrimidin-Ringe den Raum
nicht ausfüllen könnten. Die Anzahl der
Wasserstoffbrücken bestimmt unter anderem die Stabilität
der Doppelhelix. H-Brücken bilden sich zwischen einem H einer
OH- oder NH-Gruppe und einem einsamen Elektronenpaar eines O-Atomes
bzw. eines N-Atomes aus, wenn die Gruppen sich auf eine Distanz von
ca. 0,28nm annähern. Die Bindung ist nicht sehr stark, mehr als
10mal schwächer als eine Hauptvalenzbindung.
Unterschiede in der Stabilität entstehen dadurch, dass die
Basenpaare unterschiedliche Anzahlen von H-Brücken ausbilden:
während Guanin und Cytosin drei H-Brücken bilden, findet
man zwischen Adenin und Thymin nur zwei. Dies hat zur Folge,
dass die Stabilität der Doppelhelix mit höherem Anteil an G
- C -Paarungen zunimmt.
Den grössten Einfluss auf die Stabilität der Doppelhelix
haben die hydrophoben Kräfte, die zwischen den relativ nah
übereinander liegenden ("stacked") Basen wirken (der Abstand
beträgt etwa 0.26-0.34nm). Jedes Basenpaar ist im Vergleich zum
Nachbar-Basenpaar um ca. 36° um die Achse der Helix gedreht, so
dass etwa 10 Basenpaare eine vollständige Umdrehung von
360° ergeben.
Die oben beschriebene DNA ist die häufigste Form und wird als
B-Form bezeichnet. Je nach Wasser- und Salzgehalt des Mediums kann
die DNA aber eine unterschiedliche Geometrie einnehmen. Andere
charakteristische Strukturen sind die A- und die B-DNA, über die
Sie im Atelier am Posten "Struktur von Nukleinsäuren"
näheres erfahren können.
Das "Rückgrat" der Doppelhelix wird durch die Verknüpfung der Zucker mit den Phosphaten gebildet, womit die Peripherie der Helix zu einer hydrophilen Hülle wird. Die negativen Ladungen der Phosphatreste bewirken eine Abstossung der beiden Stränge. Dies wird durch die Bindung von Kationen an die Phosphate vermindert oder verhindert (Neutralisation von Ladungen). Zucker und Phosphat sind esterartig verbunden, Zucker und Base sind N-glycosidisch verbunden.
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Weshalb bilden Adenin und Guanin in der DNA keine Basenpaare? |
Wenn man DNA untersuchen will, muss man sie zuerst aus Zellen isolieren. Dazu sind folgende Schritte notwendig:
1. Beschaffen von Zellmaterial
3. Unlösliche Teile abzentrifugieren
4. Nukleinsäuren von Proteinen trennen und reinigen
6. Nukleinsäuren mit Alkoholen fällen
7. Nukleinsäuren in Puffer lösen
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Video-Clips: DNA-Isolierung im Labor |
Technische Hinweise | ||
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die Details zur DNA-Isolation. |
Was geschieht, wenn man DNA erwärmt? Die Doppelhelix bleibt
nicht stabil, sondern trennt sich in die beiden Einzelstränge.
Diesen Vorgang nennt man Denaturierung oder Schmelzen.
Die Stränge der DNA trennen sich, weil die
Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basenpaaren
bei hohen Temperaturen (z.B. 90°C) gelöst werden (die
benötigte Temperatur ist unter anderem von der Länge der
DNA und vom G-C-Gehalt abhängig). Dabei ändern sich die
physikalischen Eigenschaft der DNA, z.B. Viskosität,
Lichtabsorption. Man spricht bei diesem Aufbrechen der Helixstruktur
von einem Schmelzvorgang und definiert den Schmelzpunkt Tm
der DNA als die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA als
Einzelstränge vorliegt.
Wie wir vorher gesehen haben, bilden die beiden möglichen
Basenpaare A-T resp. G-C eine unterschiedliche Anzahl an
Wasserstoffbrücken aus (G-C drei, A-T zwei). Somit ist der
Schmelzpunkt abhängig von der Anzahl G-C Basenpaare, weil diese
der Helix eine grössere Stabilität verleihen und der
Schmelzpunkt Tm einer G-C reichen DNA höher als
derjenige einer A-T reichen DNA.
Beispiel: Veränderung der Lichtabsorption der DNA bei der Denaturierung
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Unter geeigneten Bedingungen lassen sich denaturierte ("geschmolzene") DNA-Abschnitte wieder in die doppelsträngige Form überführen. Diesen Vorgang nennt man Renaturierung. Die Geschwindigkeit dieses Vorganges ist von verschiedenen Faktoren abhängig:
- von der Konzentration der DNA und der Anzahl gleichartiger Sequenzen
- von der Konzentration an Kationen, welche negative Ladungen von Phosphaten neutralisieren
- von der Temperatur (die günstigste Temperatur liegt ca. 25°C unter dem Tm)
Die Geschwindigkeit der Reassoziation wird als Produkt der DNA-Konzentration Co und der Renaturierungszeit t ausgedrückt, sogenannter Cot-Wert.
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Praktisches Vorgehen bei der Renaturierung |
Der Vorgang der Renaturierung kann erweitert werden, indem man zwei beliebige komplementäre Nukleinsäuresequenzen miteinander paaren und eine doppelsträngige Struktur bilden lässt. Wenn Nukleinsäuren verschiedenen Ursprungs beteiligt sind, dann spricht man von Hybridisierung z.B. RNA mit DNA oder DNA mit strukturell verwandter DNA. Das Prinzip der Hybridisierung besteht darin, zwei Präparationen mit einzelsträngiger Nukleinsäure zu mischen und dann den doppelsträngigen Anteil, der gebildet wurde zu bestimmen. Dieser Vorgang ist die Basis moderner molekularbiologischer Techniken.
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Video-Clips: Hybridisierung im Labor |
Technische Hinweise | |||
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Chemie der Nukleinsäuren |
Chemie der Zucker |
Weitere Zusatzliteratur |
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