Im folgenden Abschnitt wird die Isolation von DNA am Beispiel von menschlicher DNA illustriert. Der erste Schritt beim Analysieren von DNA ist das Beschaffen von Zellmaterial. Je nach Zweck der Untersuchung, pränatale Diagnostik oder Routinetests bei Erwachsenen, eignen sich dazu die Chorionbiopsie, die Amniozentese (Fruchtwasserpunktion) oder eine einfache Blutentnahme.
Zugabe von hypotonem Puffer zur Suspension mit freien Zellen
bringt die Zellmembranen aus osmotischen Gründen zum Platzen.
Eventuell werden noch DNase - Inhibitoren hinzugegeben (Verhindern
der Hydrolyse der DNA!).
Freie Zellen lassen sich also sehr schnell und einfach aufschliessen.
Wie dieser Schritt bei tierischen Geweben oder bei Bakterienzellen
vor sich geht, können Sie im folgenden Abschnitt entnehmen:
|
|
Aufschliessen der Zellen bei tierischen Geweben oder bei Bakterienzellen |
|
a) |
Zugabe des Detergenz SDS (Sodium-Dodecyl-Sulfat). SDS ist ein ionisches Detergenz (Substanz mit hydrophilem und hydrophobem Teil; Seife), ist bei neutralem pH negativ geladen und hebt die ionischen Interaktionen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen auf: Die Kernmembran wird also aufgelöst und die Proteine von den Nukleinsäuren gelöst. |
|
|
Eine Auswahl von Proteinen, welche an Nukleinsäuren gebunden sind (ohne Besprechung der genaueren Bedeutung). |
|
b) |
Zugabe von Proteinase K: Die Proteine werden hydrolysiert |
|
c) |
Zugabe von Phenol, einem organischen Lösungsmittel (hydrophob), zur Denaturierung der noch übriggebliebenen Proteine -> die Proteine verklumpen |
|
|
Durch die Zentrifugation werden die organische und die wässrige Phase voneinander getrennt. Proteinaggregate liegen in der Interphase, die hydrophilen Nukleinsäuren (DNA und RNA) in der wässrigen Phase können nun abpipetiert werden.
Die Nukleinsäuren sind noch mit andern wasserlöslichen Komponenten verunreinigt und stark verdünnt. Durch Ausfällung mit Alkoholen (Aethanol oder Isopropanol) werden die Nukleinsäuren weiter gereinigt. Um eine bessere Ausfällung zu erhalten, wird vor der Alkoholzugabe NaCl zugegeben. Die Natrium-lonen neutralisieren die negativen Ladungen der DNA, so dass die Fällung leichter wird. H-lonen bewirken dasselbe wie Na-lonen, (allerdings in geringerem Ausmass), weshalb ein tiefes pH die Ausfällung begünstigt.
Die Nukleinsäuren liegen nun als Aggregate vor. Um mit ihnen arbeiten zu können, müssen sie in Pufferlösung wieder gelöst werden.
Dieser Schritt muss nicht zwingend als letztes gemacht werden:
- Zugabe von RNasen oder DNasen (je nach Problemstellung) oder
- Dichtegradientenzentrifugation
Film "DNA-lsolation", ca 7 Min.
 |
 |
 |
|
|
Chemie der Nukleinsäuren |
Chemie der Nukleinsäuren |
