Die Replikationsgabel |
DNA-Polymerase | Die
Richtung der Replikation | Das
DNA-Replikase-System |
DNA-Helicasen |
DNA-Topoisomerasen
Die Replikation beginnt an einem Startpunkt. Sie kann uni- oder bidirektional erfolgen, je nachdem ob sich eine oder zwei Replikationsgabeln vom Startpunkt (Origin) wegbewegen. Bei der bidirektionalen Replikation bewegen sich die beiden Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung:
Schema der Replikationsgabeln
Mittels radioaktivem Thymin im Nährmedium (Experiment) fand John Cairns heraus, dass an einem oder beiden Enden der gebildeten Replikationsgabel die Elternstränge entspiralisiert und die aufgetrennten Stränge rasch repliziert werden.
|
|
Experiment von John Cairns |
top
In der Replikationsgabel synthetisiert ein Multienzymkomplex die beiden Tochterstränge. Dieser Enzymkomplex enthält neben anderen Proteinen die DNA - Polymerasen, welche Desoxynukleotide zu langen Polynukleotidketten verknüpfen. Das Bakterium E. coli enthält drei verschiedene DNA - Polymerasen, die meisten eukaryontischen Zellen dagegen deren fünf oder mehr, die sich in ihrer Struktur und Funktion unterscheiden.
zu: "Korrekturlese"-Mechanismus der DNA-Polymerase (Kapitel: Mutationen, Mutagenese und Reparaturmechanismen)
|
|
verschiedene Arten von DNA-Polymerasen bei Escherichia coli |
|
|
verschiedenen DNA-Polymerasen bei eukaryontischen Zellen |
Die grundlegende Reaktion der DNA-Polymerasen ist immer dieselbe: Das Enzym katalysiert den nucleophilen Angriff der 3'-Hydroxylgruppe des Nucleotides am 3'-Ende des wachsenden DNA-Stranges auf das 5' a-Phosphoratom des anzuhängenden 2'-Desoxynukleotid-5'-triphosphats:
Die allgemeine Reaktionsgleichung lautet:
Mit dNMP und dNTP sind die Desoxy-Nukleotidmono- bzw. triphosphate gemeint.
Für die Polymerisation (Verlängerung) sind zwei zentrale Voraussetzungen notwendig:
1. Es braucht eine Matrize (Erklärung dazu im Unterkapitel "Allgemeines")
2. Es ist ein Primer (Startermolekül) erforderlich
Ein Primer ist ein kurzer Nukleinsäurestrang mit einer freien 3'-Hydroxylgruppe am Ende. DNA-Polymerasen können nur Nukleotide an einen bereits vorhandenen Strang anfügen, nicht aber die Synthese eines neuen Stranges starten.
Prozessivität: Wenn die DNA-Polymerase an einen Primer
gebunden und das erste Nukleotid angehängt hat, gibt es für
sie zwei Möglichkeiten: entweder sie dissoziiert ab und lagert
sich später wieder an oder sie bewegt sich auf der Matrize
vorwärts und hängt weitere Nukleotide an. Diese
Eigenschaften wird als Prozessivität einer Polymerase definiert:
Der Grad der Prozessivität ist durch die Anzahl Nukleotide
gegeben, die die Polymerase im Durchschnitt an den neuen Strang
anhängt, bevor sie abdissoziiert. Die Prozessivität wird
durch Anlagerung eines Proteinkomplexes an die DNA-Polymerase
gesteuert.
 Lösung |
Überlegen Sie sich, was die Prozessivität einer Polymerase steigern könnte. In der Lösung finden Sie die Angaben bezüglich der Prozessivität der drei DNA-Polymerasen von E. coli. |
|
|
Genauigkeit: Die DNA-Polymerasen arbeiten sehr exakt: Bei E. coli tritt nur bei jedem 109 bis 1010 Einbau eines Nukleotids ein Fehler auf.
|
Lösung |
Das Genom von E. coli hat ca. 4.6x106 Basenpaare. Wieviele Replikationen des Genoms können stattfinden, bis ein Fehler auftritt? |
Während der Polymerisation beruht die Unterscheidung zwischen "richtigen" und "falschen" Nukleotiden auf den Wasserstoffbrücken, die eine korrekte Paarung zwischen den komplementären Basen festlegen. Falsche Basen können nicht die richtigen Wasserstoffbrücken bilden und werden damit zurückgewiesen. Dies allein reicht aber noch nicht aus, um die hohe Präzision der Polymerisation zu erklären. Die Fehlerrate wird in vivo durch zusätzliche enzymatische Mechanismen weiter reduziert, z.B. durch die 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Sie ist eine eigenständige Aktivität der Polymerase. Diese Nukleaseaktivität ermöglicht es dem Enzym, ein gerade eingebautes Nukleotid wieder zu entfernen. Wenn ein falsches Nukleotid eingebaut wurde, ist die Weiterbewegung der Polymerase zur Bindungsstelle des nächsten Nukleotids blockiert. Durch die 3'-5'-Exonucleasewirkung wird das falsche Nukleotid entfernt und das korrekte Nukleotid eingebaut. Diese Funktion wird als Korrekturlesen bezeichnet.
Zu Korrekturmechanismus der DNA-Polymerase (im Kapitel: "Mutation, Mutagenese und Reparaturmechanismen")
Wir haben gesehen, dass ein Nukleotid immer an die 3'-Hydroxylgruppe des neuen Stranges angehängt wird und die neue Kette somit in 5'-3'-Richtung wächst. Diese Tatsache führt aber zu einem Problem:
Wenn die Synthese immer in 5'-3'-Richtung vorwärtsschreitet, wie können dann beide DNA-Stränge gleichzeitig synthetisiert werden?
Stellen wir uns eine Replikationsgabel vor. Der Eltern-Doppelstrang wird aufgetrennt und dient als Matrize. Die beiden Stränge weisen aber nicht dieselbe Orientierung auf: da sie antiparallel angeordnet sind, weist der eine Strang eine 3'-5'-Orientierung auf und der andere eine 5'-3'-Orientierung. Sehen wir uns zuerst den 3'-5'-Elternstrang an, dieser kann in 5'-3'-Richtung direkt repliziert werden (gestrichelt):
Der 5'-3'-Strang aber hat die "falsche" Richtung. Reiji Okazaki fand in den 60er Jahren heraus, dass an diesem Strang viele kurze Stücke in 5'-3'-Richtung synthetisiert werden, welche man nach ihm als Okazaki-Fragmente bezeichnet. Die Länge dieser Fragmente hängt vom Zelltyp ab und beträgt einige hundert bis zweitausend Nucleotide:
Somit wird der eine Strang kontinuierlich (Leitstrang) und der andere diskontinuierlich (Folgestrang) synthetisiert. Der kontinuierliche Strang ist derjenige, bei welchem die Synthese des neuen Stranges in der gleichen Richtung läuft wie die Replikationsgabel. Beim diskontinuierlichen Strang läuft die Synthese in die Gegenrichtung der Replikationsgabel.
Bei der Replikation wirken in der Replikationsgabel neben der Polymerasen noch viele weitere Enzyme und Proteine mit, welche in ihrer Gesamtheit als DNA-Replikase-System resp. Replisom bezeichnet werden.
RNA-Primase / DNA-Ligase
Zu Beginn der Replikation wird ein Primer benötigt. Am
Leitstrang kann von diesem Primer aus der neue Strang
kontinuierlich gebildet werden, da immer ein basengepaartes
Kettenende für die weitere Synthese zur Verfügung steht. Am
Folgestrang jedoch kann die Polymerase nur eine kurze Zeit
lang wirken, dann muss der Polymerisationsprozess weiter vorne von
neuem beginnen. Dafür ist jedes Mal von neuem ein Primer
nötig. Dieser basengepaarte Primer-Strang wird durch ein Enzym,
die RNA-Primase, synthetisiert. Bei Eukaryonten haben die
Primer eine Länge von ungefähr 10 Nucleotiden. Diese
RNA-Stücke werden in Abständen am Folgestrang synthetisiert
und anschliessend durch die DNA-Polymerase zu einem Okazaki-Fragment
verlängert. Diese Synthese endet am 5'-Ende des vorhergehenden
Fragments. Damit nun ein kontinuierlicher Strang entsteht, der keine
RNA-Stücke enthält, tritt noch während der Replikation
ein Reparaturmechanismus in Aktion: Eine RNase H (in E. coli Teil der
DNA-Polymerase I) entfernt die RNA-Primer und eine DNA-Polymerase
füllt die entstandene Lücke mit DNA.
Die DNA-Ligase schliesst dann die Bindung vom 3'-Ende des
neuen zum 5'-Ende des alten DNA-Stückes und beendet damit den
Vorgang.
Abbildung (DNA-Ligase)
|
|
DNA-Ligasen bei Bakterien und Eukaryonten |
Damit die Replikation überhaupt ablaufen kann, muss der DNA-Doppelstrang (Elternstrang) getrennt werden. Dies bedeutet Schmelzen der DNA über einen kurzen Bereich. Das Entwinden wird von den DNA-Helicasen katalysiert, Enzymen, welche sich entlang der DNA bewegen und die Stränge mittels chemischer Energie aus ATP voneinander trennen. Die freiliegenden DNA-Stränge werden durch DNA-bindende-Proteine stabilisiert.
|
|
Mechanismus und verschiedene Formen der DNA-Helicasen |
Das Auftrennen der Stränge erzeugt topologisch bedingte
Spannungen in der helicalen DNA-Struktur: Diese werden durch die
Wirkung von Topoisomerasen beseitigt. Die Mithilfe bei der
Replikation ist aber nur eine von vielen Aufgaben der Topoisomerasen.
Bei allen Reaktionen, bei denen die Topologie der DNA verändert
wird, spielen die Topoisomerasen eine wichtige Rolle, also zum
Beispiel bei der Transkription von Genen, bei der Rekombination
u.a.
Topoisomerasen öffnen vorübergehend den
Phosphodiester-Rückgrat der Doppelhelix, leiten den einen
DNA-Strang durch die entstandene Lücke und stellen dann die
Phosphodiesterbindung wieder her. Das Ergebnis dieser Reaktion ist
die Änderung der Windungszahl pro Längeneinheit und damit
der Topologie der DNA. Im Wesentlichen arbeiten die Topoisomerasen
der Eukaryonten und der Prokaryonten gleich.
Prinzip der Topoisomerase II-Reaktion:
|
|
Weitere Informationen über die verschiedenen Topoisomerasen. |
|
|
Die Topoisomerasen werden im Kapitel "Struktur von Nukleinsäuren" im Unterkapitel "Superstruktur" auch erwähnt. |
|
Lösung |
Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer DNA-Topoisomerase und einer DNA-Helicase? |
 |
 |
 |
|
Mechanismus der DNA Replikation |
Allgemeines |
Der Mechanismus |
Formel