Gendiagnostik
PCR
Bedeutung: Die Einführung der PCR-Methode Ende der 80er Jahre
hat die Anwendungsmöglichkeiten der Gentechnologie
revolutioniert. Sie ermöglicht die massive Vermehrung
(Amplifizierung) kleinster DNA-Mengen, die sonst der Analyse nicht
oder nur schwer zugänglich wären.
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Vorgehen:
- Isolierung von DNA: Als Ausgangsmaterial kann das ganze Genom
oder ein Teil des Genoms, welches das zu kopierende Genstück
enthält, verwendet werden.
- Auftrennen der Doppelstränge in Einzelstränge durch
Erhitzen der DNA. Normalerweise liegt die Temperatur um die 90
Grad C.
- Hybridisieren der Primer: Voraussetzung: Man muss die
Sequenzen an den Enden des gewünschten DNA-Bereichs kennen,
damit man zwei kurze Oligonucleotide (=Primer) synthetisieren
kann, die sich an die Ziel-DNA anlagern. Diese Oligonucleotide
begrenzen den Abschnitt, der vervielfältigt wird. Sie sind
komplementär zu einem kurzen Teil des zu analysierenden
Genabschnittes. Um die Primer an die Einzelstränge zu
hybridisieren, muss die Temperatur von 90 Grad C auf ca. 45 Grad C
reduziert werden. Die optimale Temperatur hängt von der
Länge und der Sequenz des Primers ab.
- DNA-Synthese: Als Enzym für die DNA-Synthese wird meist
die Thermus aquaticus (Taq)-Polymerase gewählt. Sie ist
hitzestabil und ihr Temperaturoptimum liegt bei 70 Grad C. Sie
synthetisiert den neuen Strang in 5'-3'-Richtung.
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