Vektoren sind Vehikel für den Transport von DNA in eine Wirtszelle. Durch Einbau eines fremden Gens in den Vektor wird ein rekombinantes DNA-Molekül konstruiert, welches sich in der Wirtszelle replizieren kann.
Bakterien (prokaryotische Zellen) beherbergen neben der chromosomalen DNA häufig noch kleine (5 bis 1000 Kilobasenpaare, kb) zirkuläre DNA-Moleküle, Plasmide, die durch die Wirtszelle unabhängig von der genomischen DNA repliziert und transkribiert werden. Medizinisch wichtig sind Resistenzplasmide: Sie enthalten Gene, welche die Wirtszelle gegen Antibiotika unempfindlich machen.
(Hier können Sie eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer Lösung mit Plasmiden ansehen)
In der Rekombinanten-DNA-Technologie werden künstlich veränderte Plasmide mit den folgenden Elementen eingesetzt:
Replikations-Ursprung (origin of replication): Er ist für die Vermehrung des Plasmids. Hier beginnt der bakterielle Replikationskomplex mit der bidirektionalen Replikation.
Selektierbare Marker-Gene: Sie ermöglichen das Selektionieren von Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen haben (z.B. Resistenzgene).
Restriktionsenzym-Schnittstellen: Sie sind wichtig für das Einfügen von fremder DNA. Eine solche Schnittstelle sollte nur einmal in einem Plasmid vorkommen.
Plasmide können nach Bedarf im Labor hergestellt werden. Künstlich veränderte Plasmide enthalten oft sogenannte "Polylinker". Das sind hintereinander geschaltete Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme.
Etwas grössere DNA-Segmente können bei der Verwendung des Bakteriophagen Lambda als Vektor kloniert werden. Der Bakteriophage Lambda verfügt über einen sehr wirkungsvollen Mechanismus, um seine aus 48 502 Basenpaaren bestehende DNA in eine Bakterium einzuschleusen.
Das allgemeine Verfahren zur Klonierung von DNA im Bakteriophagen Lambda beruht auf zwei Schlüsselmerkmalen des Bakteriophagen Lambda-Genoms:
Man hat Bakteriophagen Lambda-Vektoren entwickelt, die leicht in drei Stücke gespalten werden können; zwei davon enthalten essentielle Gene und haben zusammen eine Länge von etwa 30 000 Basenpaaren. Zur Erzeugung "lebensfähiger" Phagenpartikel muss daher zusätzliche DNA zwischen ihnen eingefügt werden. Mit Bakteriophagen Lambda-Vektoren lassen sich DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 23 000 Basenpaaren klonieren, und ihr Aufbau stellt sicher, dass alle lebensfähigen Phagenpartikel ein Fremd-DNA-Fragment enthalten. Sobald die Fragmente des Bakteriophagen Lambda mit Fremd-DNA-Fragmenten geeigneter Grösse verbunden worden sind, kann die resultierende rekombinierte DNA in Phagenpartikel verpackt werden, indem man sie zu bakteriellen Rohzellextrakten gibt, die alle zum Zusammenbau eines vollständigen Phagen benötigten Proteine enthalten. Man nennt dieses Verfahren in-vitro-Verpackung. Der Bakteriophagenvektor ist nun für die Insertion der rekombinierten DNA in E.coli-Zellen vorbereitet.
Cosmide sind rekombinierte Plasmide, die nützliche Merkmale sowohl der Plasmide als auch des Bakteriophagen in sich vereinigen. Sie sind für die Klonierung noch grösserer DNA-Fragemente entwickelt worden.
 |
 |
|
Gen-Klonierung |
DNA Isolierung/Plasmid Isolierung |
top