Isolierung von Genen
Methoden zur Isolation eines Klons
Nucleinsäure-Hybridisierung
- Prinzip:
- Zwei Nucleotidstränge, welche komplementäre Basen
tragen, können sich zusammenlagern und einen Doppelstrang
bilden. Diese Hybride können auch dann stabil sein, wenn
einzelne Nucleotide nicht zusammenpassen. Es spielt keine Rolle,
ob es sich bei den Strängen um RNA oder DNA handelt.
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- Gen-Sonden:
- Eine Sonde ist eine Nukleotid-Sequenz, die für eine
Hybridisierung, d.h. zum Nachweis einer komplementären
Sequenz in einer Nucleinsäureprobe eingesetzt wird.
- Es kann eine klonierte cDNA zur Isolierung des Gens eingesetzt
werden.
- Ist die Aminosäuresequenz des Proteins, das vom gesuchten
Gen codiert wird, bekannt, kann man anhand des genetischen Codes
die Nucleotidsequenz des dazugehörigen Gens ableiten. Das
künstliche Gen, das so synthetisiert wird, ist nur teilweise
komplementär zur gesuchten DNA, da eine Aminosäure oft
von mehreren Codons bestimmt wird. Bsp: Die Codons für die
Aminosäure Alanin sind GCA, GCT, GCG und GCC. Zwei der drei
Nucleotide im Codon für Alanin können mit Sicherheit
vorhergesagt werden. Ein künstlich erzeugtes Gen hat in der
Regel genügend Aehnlichkeit, um als Sonde eingesetzt werden
zu können:
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- Gehört das gesuchte Gen zu einer Genfamilie, kann ein
anderes Gen aus dieser Familie als Sonde verwendet werden, da
diese Gene oft genügend Sequenzidentität haben.
- Vorgehen:
- Die Klone werden auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran
aufgetragen und dort lysiert. Die DNA wird auf der Membran
denaturiert, d.h. es entstehen DNA-Einzelstränge. Diese
werden mit ihrem Zucker-Phosphat-Rückgrat fest an die Membran
gebunden. Die markierten Sonden werden zugegeben. Sie
hybridisieren mit den DNA-Einzelsträngen. Die Membran wird
gewaschen, um die nichtgebundenen Sonden zu entfernen. Die Lage
der gebundenen Sonden wird nachgewiesen.
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- Markierung der Sonden:
- Einbau von radioaktiven Nucleotiden. Die Bindung der
Nucleotide an die Sonde kann durch Autoradiographie nachgewiesen
werden.
- Einbau von Nucleotiden, an welche Biotin gekoppelt wurde.
Biotin hat eine hohe Affinität zum Protein Avidin. Nach dem
Hybridisieren mit der biotinylierten Nucleotidsonde wird die
Membran mit Avidin gewaschen. Avidin wird zuvor mit einem
Fluoreszenz-Marker gekoppelt und kann so sichtbar gemacht werden.
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Immunscreening
Man identifiziert mit Antikörpern das Protein, das vom
gesuchten Gen codiert wird. Voraussetzung: Das Gen muss von der
transformierten Zelle exprimiert werden.
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